Монография "Бифункциональный препарат Тубосан"

ГЛАВА 2. БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ - ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗ­НЫЕ И ИММУНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА ТУБОСАНА ПО РЕ­ЗУЛЬТАТАМ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2.

БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ - ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ

И ИММУНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА ТУБОСАНА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ


2.1   Характеристика Тубосана как фармакологического препарата
Тубосан - метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникоти- ноил гидразид - внесен в Государственный реестр лекарственных средств под № ЛСР - 006593 / 08 — 140808. Относится к классу имму- нотропных веществ ATX: L03 АХ иммуностимуляторы другие.
Метилдиоксотеграгидропиримидин сульфонизоникотиноил гид­разид был впервые синтезирован и использован для лечения лепры и туберкулеза профессором, д.м.н. Н.М. Голощаповым и зарегистриро­ван как препарат «Изофон» в (Патент РФ 2141322. Опубликован 20.11.1999). Тубосан состоит из пиримидинового производного (6- метилурацил), сульфоновой группы (SO2) и антимикобакгериальной группы в изониазиде.

Пиримидиновая группа определяет наличие иммуномодулирую­щих свойств, за счет которой также достигается значительное сниже­ние токсичности препарата по сравнению с изониазидом.
Сульфоновая группа усиливает антимикобактериальный эффект гидразида изоникотиновой кислоты и других антимикобактериальных препаратов, используемых в лечении больных туберкулезом.
Прототипом для создания метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразида (изофона, тубосана) явился диуци­фон - пара-пара-бис (2,4-Диоксо-6-метилпиримидинил-5-сульфона- мино)-дифенилсульфон. Препарат содержит две пиримидиновые и сульфоновые группы.


Диуцифон - уникальная российская разработка, был синтезиро­ван по идее Н.М. Голощапова в 1967 г. в Институте органической и физической химии АН СССР и применялся вначале как противоле- прозный препарат, обладающий иммуномодулирующим эффектом. Диуцифон вошел во все классические руководства по иммунотерапии как препарат, восстанавливающий все звенья иммунитета - Т- и В- клеточное, усиливающий фагоцитоз и стимулирующий обменные и репаративные процессы. Среди возможных механизмов действия диуцифона на иммунную систему наиболее вероятен механизм пер­вичного воздействия на рецепторное поле лимфоцитов, улучшающих межклеточную кооперацию, с повышением синтеза лимфокинов, в том числе интерлейкина 2, а также улучшение функций лимфоцитов и других клеток посредством усиления синтеза РНК в клетках. Пре­парат с успехом применялся для лечения различных иммунодефицит­ных состояний, в т.ч. при деструктивном туберкулезе (Хоменко А.Г., Инсанов А.Б., 1984). Отличительной особенностью диуцифона из все­го класса иммуномодуляторов явилась способность потенцировать действие антибиотиков и проявлять иммуностимулирующий эффект в присутствии выраженных иммуносупрессивных факторов, таких как глубокий эндотоксикоз, лечение иммунодепрессантами. Возможность применения диуцифона при аутоиммунных и аллергических заболе­ваниях позволило существенно расширить спектр применения имму­нотерапии при заболеваниях, сопровождающихся иммунодефицитом. Препарат оказался эффективным не только для лечения тяжелых ин­фекционно-воспалительных заболеваний - сепсиса, абсцедирующих пневмоний, но и для лечения коллагенозов, бронхиальной астмы, синдрома Лайела и др.
Эффективное применение диуцифона в лечении вторичных им­мунодефицитов, в том числе при инфекционных (лепра, туберкулез, сифилис, хламидийная инфекция и др.) и гнойно-воспалительных за­болеваниях сформировало теоретические предпосылки для создания метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразида - как противолепрозного и противотуберкулезного препарата с анти- микобактериальной и иммунотропной активностью.
Препарат Тубосан - метилдиоксотетрагидропиримидин сульфо­низоникотиноил гидразид готовится из субстанции «Кристафон», идентичной субстанции «Изофон», зарегистрированной в 1999 г., но полученной по новой технологической схеме синтеза и защищенной патентом РФ (Патент № 2235723. Способ получения N-(6- метил- 2,4- диоксо- 1,2,3,4-тетрагидро- 5-пиримидинсульфон)- N'-изоникотино- илгидразида/ Приоритет от 21.09.2003г.). Проведенное сравнительное изучение вышеуказанных субстанций подтвердило структурное и фи­зико-химическое сходство указанных молекул (Отчеты).
Доклиническое изучение Тубосана проведено в отделе доклини­ческих исследований ФГУП "ГНЦА", отделе прикладной иммуноло­гии Вирусологического центра НИИ микробиологии МО РФ, Лабора­тории методов скрининга канцерогенов НИИ канцерогенеза (ГУ "Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина" РАМН) и лаборатории генетического мониторинга (ГУ "НИИ эколо­гии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина" РАМН) в соответствии с требованиями Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Хабриев Р.У. и соавт., 2005). Препарат сравнения - Изофон (Отчеты).

Рис.36. Концентрация метилдиоксотетрагидропиримидина в крови кро­ликов после однократного введения внутрь 200 мг препаратов



Изучение фармакокинетики метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразида на кроликах при однократном вве­дении внутрь 200 мг показало, что максимум концентрации (80,9 - 75,0 мкг/мл) наблюдается через 3-6 час, соответственно, с сохранени­ем в крови до 12-18 часов (10,7 мкг/мл) (рис. 36).

Выводится препарат 50% через желудочно-кишечный тракт.
Изучение острой токсичности на белых мышах и белых крысах показало, что величины токсических доз метилдиоксотетрагидропи­римидин сульфонизоникотиноил гидразида превышают уровень 15000 мг/кг массы, что позволяет отнести препарат к IV классу токсичности "Относительно безвредные вещества". ЛД50 такого основного проти­вотуберкулёзного средства, как изониазид, составляет 150 мг/кг.
Состояние шерстного покрова и слизистых, характер выделений, поведенческие реакции, динамика прироста массы тела у подопытных животных не отличались от тех же параметров у контрольных. В до­зе 200 мг у белых мышей и кроликов каких-либо значимых измене­ний массы тела, температуры, гематологических и биохимических показателей периферической крови препарат не вызывал. Изучение субхронической токсичности метилдиоксотетрагидро­пиримидин сульфонизоникотиноил гидразида на белых крысах в до­зах, 20 и 40 раз превышающих дозу для человека (700 и 1400 мг/кг per os соответственно), показало, что за период наблюдений (14 дней) от­клонений во внешнем виде, состоянии шерстного покрова, характере выделений, поведенческих реакциях, динамике прибавки массы тела, показателях функционального состояния ЦНС как у самок, так и у самцов подопытной группы животных по сравнению с контролем не выявлено.
Диурез и величины относительной плотности мочи у животных после курса введения внутрь Тубосана и Изофона, уровни креатинина и мочевины, белка, ACT, АЛТ и щелочной фосфатазы, триглицери­дов, холестерина и глюкозы в сыворотке крови подопытных крыс не отличались от показателей в контроле. Продолжительность гексена- лового сна по сравнению с контрольной группой также не менялась.
Изучение картины периферической крови, лейкоцитарной фор­мулы, показателей свертываемости крови показало отсутствие изме­нений у крыс, получавших как Тубосан, так и Изофон, по сравнению с контролем.
При макроскопическом исследовании внутренних органов (серд­це, легкие, почки, селезенка, желудок, кишечник) у животных обоего пола после введения внутрь исследуемых препаратов в дозе 700 мг/кг и 1400 мг/кг в течение 14 дней визуальных патологических измене­ний не обнаружено.
Морфометрический анализ отличий в относительной массе внут­ренних органов животных подопытной и контрольной групп не выявил.
Патоморфологическое и патогистологическое исследование не выявило существенных изменений у подопытных крыс по сравнению с контрольными животными. Местнораздражающее действие на же­лудочно-кишечный тракт животных после введения исследуемых препаратов в обеих дозах также не было выявлено.
Изучение на морских .свинках и белых мышах аллергизирующих свойств метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразида при однократном внутрикожном, одно- и многократном внутрижелудочном введении с помощью конъюнктивальной и эпикутанной проб, определения количества эозинофилов в крови, влияния на активацию факторов высвобождения медиаторов воспаления по­зволило сделать вывод об отсутствии у препарата аллергизирующих свойств.
Специфическая репродуктивная токсичность метилдиоксотетра­гидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразида была изучена на белых крысах при внутрижелудочном введении препарата в дозах 700 и 1400 мг/кг. Исследование эмбрионального материала показало, что введение самкам испытуемого препарата в разные сроки беременно­сти не вызывало по сравнению с контролем увеличения до- и постим­плантационной гибели эмбрионов, не изменяло массу и краниокаудальный размер плодов, не увеличивало у них число аномалий во внутренних органах и дефектов развития в скелетной системе. У по­томства, рожденного от матерей-крыс, получивших исследуемый препарат с 1-го по 20-й день беременности, по показателям эмоцио­нально-двигательного поведения и координации движений патологи­ческих отклонений не выявлено. Введение метилдиоксотетрагидро­пиримидин сульфонизоникотиноил гидразида в течение длительного времени крысам (самкам и самцам) не оказывало токсического влия­ния на их репродуктивную функцию. Обобщенная оценка получен­ных результатов позволила сделать вывод об отсутствии у препарата "Тубосан капсулы 200 мг" репродуктивной токсичности.
Изучение мутагенной активности метилдиоксотеграгидропири- мидин сульфонизоникотиноил гидразида с помощью метода обнару­жения генных мутаций в микробной тест-системе Salmonella/мик­росомы показало, что экстракты не содержат мутагенов прямого и непрямого действия, которые индуцировали бы мутации типа сдвига

рамки считывания генетической информации. Эффект непрямых му­тагенов, индуцирующих мутации типа замены пар оснований, также не обнаруживается. Эффект прямых мутагенов этого же типа в изу­ченном диапазоне концентраций отсутствует.
В тесте индукции хромосомных аберраций в клетках костного мозга белых мышей при одно- и четырехкратном введении внутрижелудочно 300 мг/кг массы мутагенная активность Тубосана не выявле­на. Мутагенная активность не выявлена также при однократном вве­дении препарата самцам в дозе 4500 мг/кг .
Полученные результаты с учетом данных по изучению мутаген­ной активности метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразида позволили Комиссии по канцерогенным факторам Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благо­получия человека сделать вывод о малой вероятности наличия канце­рогенных свойств у препарата.
Оценка иммунотропной активности на доклиническом этапе в первом исследовании показала, что метилдиоксотетрагидропирими­дин сульфонизоникотиноил гидразид вызывает у белых мышей суще­ственный прирост количества антителообразующих клеток. Индекс стимуляции, определяемый по количеству антителообразующих кле­ток, при использовании метилдиоксотетрагидропиримидин сульфо­низоникотиноил гидразида, производства «Биофарм Право Альфа», составил 5,0 - 5,4, что в 2,8 раза выше, по сравнению с прототипом (пара-пара - бис - дифенилсульфоном), у которого индекс стимуля­ции составил 1,8.
Во втором исследовании иммунотропных свойств тубосана на модели вторичного иммунодефицита у белых мышей, вызванного частичным голоданием, было установлено, что метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразид вызывает более быст­рую и полную нормализацию иммунного статуса по всем параметрам, по сравнению с контролем. В исследовании также наблюдался существенный прирост массы тела у животных, получающих препарат,
улучшение внешнего вида и поведенческих реакций, что показывает наличие у метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразида анабс^пических свойств. Ранее Н.М. Голощаповым (2002) было выявлено наличие выраженных иммунокоррегирующих свойств метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразида (изофона) на модели иммунодефицита, вызванного облучением.


На третьем этапе изучения иммунной активности метилдиоксо­тетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидразида было уста­новлено, что двукратное введение 200 мг препарата белым мышам внутрь в течение 5 дней способствует повышению иммуногенности вирусных вакцин (венесуэльский энцефаломиелит лошадей). Титр ан­тител в опытной группе составил 1:479, против 1:111 в контрольной. Изучение эффективности метилдиоксотетрагидропиримидин сульфо­низоникотиноил гидразида на модели инфекционного процесса у морских свинок, зараженных вирусом венесуэльского энцефаломие­лита лошадей, штамм 15, показало, что профилактическое введение препарата защищает от заболевания 40% морских свинок и сущест­венно снижает как клинические, так и вирусологические показатели инфекционного процесса у заболевших животных.
При доклиническом изучении иммунотропных свойств изофона (Голощапов Н.М., 2002) установлено, что метилдиоксотетрагидропи­римидин сульфонизоникотиноил гидразид усиливает у белых мышей гиперчувствительность замедленного типа к эритроцитам барана на 7-56% и оказывает стимулирующее влияние на фагоцитоз. Вероятный механизм действия препарата на иммунные клетки лежит в сходном с диуцифоном и другими пиримидиновыми основаниями рецепторном поле лимфоцитов и улучшении синтеза РНК клетками, что позволяет отнести данный препарат к классу иммуностимуляторов с действием, подобным заместительному, когда в клетку предоставляются «строи­тельные» вещества и нормализуются обменные процессы с одновре­менной их активацией.
Таким образом, доклинические исследования препарата Тубосан - метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизоникотиноил гидрази­да по параметрам острой и субхронической токсичности, мутагенно­сти, эмбриотоксичности, тератогенности и канцерогенности, а также аллергенных и иммуномодулирующих свойств показали его низкую токсичность и безопасность. Наличие выраженных иммуномодули­рующих свойств у метилдиоксотетрагидропиримидин сульфонизони­котиноил гидразида с улучшением содержания и функций Т- и В- лимфоцитов, усилением фагоцитоза, анаболическое действие позво­ляют отнести тубосан к «универсальным» иммуномодулирующим препаратам, применение которого с высокой степенью вероятности будет эффективным при любой форме и фазе туберкулезного процес­са, вне зависимости от степени иммунодефицита и формулы иммун­ных расстройств.