Монография "Бифункциональный препарат Тубосан"

2.2 Противотуберкулезная активность тубосана на лекарственно чув­ствительные и лекарственно устойчивые штаммы микобактерий ту­беркулеза in vitro

2.1 Противотуберкулезная активность Тубосана

на лекарственно чувствительные и лекарственно устойчивые

штаммы микобактерий туберкулеза in vitro

Изучена бактериостатическая и бактерицидная активность Тубо­сана в концентрации 20, 60, 80 и 100 мкг/мл, на клинических образцах мокроты в отношении изониазид-чувствительных и изониазид- резистентных штаммов МБТ, обладающих множественной и широкой лекарственной устойчивостью.
Исследование проведено на 53 клинических штаммах МБТ, выде­ленных от больных деструктивными формами туберкулеза, в лечении которых ранее не использовался Тубосан (Протокол 1,2). Из 53 иссле­дуемых штаммов в 13 случаях МБТ сохраняли чувствительность ко всем противотуберкулезням препаратам, в 3 случаях наблюдалась ус­тойчивость к 1-3 препаратам без изониазида, в 37 случаях наблюдалась устойчивость к изониазиду в сочетании с другими препаратами, вклю­чая 12 случаев ШЛУ МБТ и 24 случая МЛУ МБТ. Из 37 изониазид- резистентных штаммов МБТ 14 штаммов были устойчивы к изониази­ду не только в концентрации 1 мкг/мл, но и в концентрации 10 мкг/мл.
Изучение противотуберкулезной активности Тубосана проводили в соответствии с Методикой по руководству для доклинического ис­следования противотуберкулезных препаратов in vitro (Хабриев Р.У., 2005г. с. 571-578.). В исследовании использована среда Левенштейна- Йенсена. Подсчет колоний на среде проводили через 21 день. Исполь­зована следующая шкала оценки массивности роста МБТ на средах (Приказ № 109 от 21 марта 2003 г., Приложение И. «Культуральные методы диагностики туберкулеза» под ред. В.В. Ерохина - М. - 2008 -208с.):
- - отсутствие роста МБТ на средах и отрицательный результат по микроскопии с окраской по Циль - Нильсену
+ - при росте МБТ от единичных колоний до 20 колоний
++ - при росте МБТ от 20 до 100 колоний
+++ - при росте более 100 колоний
Оценку массивности роста МБТ или отсутствие роста на среде подтверждали с помощью простой микроскопии при окраске препа­ратов по Цилю-Нильсену.
Изучены концентрации тубосана 20, 60, 80 и 100 мкг/мл. Контро­лем служили образцы тех же культур МБТ на средах без препаратов. Сравнение противотуберкулезной активности тубосана проводили с изониазидом в концентрации 1 мкг/мл.
Эффективность действия препарата оценивали как бактерицид­ную при полном подавлении роста МБТ по сравнению с контролем. 106
При уменьшении массивности роста МБТ в соотношении кон- троль/опыт +++/++, ++/+, -Н-+/+ действие препарата оценивали как бактериостатическое. При соотношении +++/++, ++/+ результат оце­нивали как умеренное бактериостатическое действие тубосана, при соотношении +++/+ результат оценивали как выраженное бактерио­статическое действие тубосана.
Обращали внимание на изменение внешнего вида колоний в срав­нении контроль/опыт. Изменение культуральных свойств - формиро­вание влажных гладких колоний с изменением цвета - оценивали как формирование S колоний и учитывали в качестве дополнительного проявления бактериостатического действия препарата при наличии ха­рактерных R колоний - шероховатых, сухих, с сероватым или желто­ватым оттенком - на средах с контролем («Культуральные методы ди­агностики туберкулеза» под ред. В.В. Ерохина - М. - 2008 - с. 101).
Результаты исследования представлены в Протоколах 1, 2.
При сохранении чувствительности МБТ к изониазиду 1 мкг/мл (например, клинические штаммы 2871, 4787, 4564) отсутствовал рост МБТ на образцах со всеми изучаемыми концентрациями тубосана (рис.37 ). Исследование показало, что тубосан в концентрациях 20, 60, 80 и 100 мкг/мл обладает бактерицидным действием на лекарственно чувствительные штаммы микобактерии туберкулеза.
мкг/мл мкг/мл кг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл МБТ 11 -I -1 I -          -             -                                            -      -
Рис. 37. Результаты посева культуры МБТ с сохранением чувствитель­ности ко всем противотуберкулезным препаратам на 21 день.

Бактерицидное действие изониазида 1 мкг/мл и тубосана 20,60, 80, 100 мкг/мл.
1   пробирка - контроль - сплошной рост культуры МБТ на среде Левен- штейна - Йенсена (+++)
2   пробирка - контроль - сплошной рост культуры МБТ на среде Левен- штейна - Йенсена в разведении * 10-6 (+++)
3   пробирка - отсутствие роста МБТ на среде Левенштейна - Йенсена с изониазидом 1 мкг/мл (-)
4,5,6 пробирки - отсутствие роста МБТ на среде Левенштейна - Йенсена с тубосаном 20,60, 80 и 100 мкг/мл (-).
При лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду 1 мкг/мл и сохранении чувствительности к изониазиду в концентрации 10 мкг/мл тубосан в концентрации 60 мкг/мл и 80 мкг/мл проявил бактерицид­ное действие (например, клинические штаммы 5170, 5245, 5033) - рост культуры МБТ отсутствовал. Тубосан также оказывал выражен­ный бактериостатический эффект в виде значительного уменьшения количества колоний по сравнению с контролем и изониазидом 1 мкг/мл (+++/+ - контроль/опыт) (рис. 38). В одном случае наблюдался умеренный бактериостатический эффект (+++/+ - контроль/опыт).

Рис. 38. Результаты посева культуры МБТ с устойчивостью к изониази­ду 1 мкг/мл, но сохранении чувствительности в концентрации изониазида 108
10 мкг/мл на 21 день (клинический штамм 6145 — лекарственная устойчи­вость МБТ - SHRKEb). Наблюдается бактерицидное действие тубосана 60 и 80 мкг/мл при устойчивости МБТ к изониазиду 1 мкг/мл и сохранении чувст­вительности к изониазиду 10 мкг/мл.
1  пробирка - контроль - сплошной рост культуры МБТ на среде Левен­штейна - Йенсена (+++)
2  пробирка — сплошной рост МБТ на среде Левенштейна - Йенсена с изониазидом 1 мкг/мл (+++)
3   пробирка - отсутствие роста МБТ на среде Левенштейна - Йенсена с
изониазидом 10 мкг/мл (-)          '
4,5 пробирки - отсутствие роста МБТ на среде Левенштейна - Йенсена с тубосаном 60 и 80 мкг/мл (-)
Заключение: Бактерицидное действие тубосана на МЛУ МБТ при ус­тойчивости к изониазиду 1 мкг/мл и сохранении чувствительности к изониа­зиду 10 мкг/мл.
При лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду 1 мкг/мл и 10 мкг/мл (например, клинические штаммы 4546, 5007, 4737), Тубо­сан в концентрации 60, 80 и 100 мкг/мл проявлял бактерицидное дей­ствие (например, штамм 4737), выраженное бактериостатическое действие в виде уменьшения массивности роста колоний МБТ(например, клинический штамм 5007) (+++/+ - контроль/опыт) и умеренное бактериостатическое действие (например, клинический штамм 4546) (+++/+ +- контроль/опыт) (рис 39).

Рис. 39. Результаты посева культуры МБТ с ШЛУ на 21 день (клиниче­ский штамм 4546 - лекарственная устойчивость МБТ - SHRKEtEbCapPAS).


В концентрациях Тубосана 20 мкг/мл и 100 мкг/мл значимого из­менения массивности роста МБТ не зарегистрировано, но также на­блюдалось образование S-типов колоний МБТ, что дополнительно указывает на бактериостатическую активность препарата.

Наши данные по антимикобактериальным свойствам тубосана, проведенные на клинических штаммах МБТ, включая МЛУ и ШЛУ ill

Наблюдается устойчивость МБТ к изониазиду 1 и 10 мкг/мл и умеренное бактериостатическое действие тубосана 60 и 80 мкг/мл
  1 пробирка - контроль - сплошной рост культуры МБТ на среде Левен-
штейна - Йенсена (+++)
 2 пробирка - контроль - сплошной рост культуры МБТ на среде Левен­; i    штейна - Йенсена в разведении * 10-6 (++)
3  пробирка - сплошной рост МБТ на среде Левенштейна - Йенсена с изониазидом 1 мкг/мл (+++)
4  пробирка - сплошной рост МБТ на среде Левенштейна - Йенсена с изониазидом 10 мкг/мл (+++)
5   и 6 пробирки - уменьшение количества колоний МБТ на среде Левен­штейна - Йенсена с тубосаном 60 и 80 мкг/мл (++). Изменение типа колоний - влажные, блестящие, гладкие, «слизистые». При микроскопии подтвержде­но уменьшение массивности роста МБТ на средах с тубосаном по сравнению с контролем и с изониазидом. При контрольном пересеве на среды без препа­ратов роста колоний МБТ не получено. Заключение: Умеренное бактериоста­тическое действие тубосана на ШЛУ МБТ при устойчивости к изониазиду 10 мкг/мл.
На всех средах с тубосаном в концентрациях 60, 80 и 100 мкг/мл, где наблюдался рост колоний микобактерий, было отмечено измене­ние вида колоний. Колонии выглядели влажными, гладкими и бле­стящими, что позволяет их отнести к S-типу колоний и характеризо­вать как бактериостатическое действие Тубосана (рис.40.). При мик­роскопии с окраской препаратов по Циль-Нильсену было подтвер­ждено наличие микобактерии в данных образцах. При пересевании культур МБТ видоизмененных в S-тип колоний, выращенных на сре­дах с Тубосаном в концентрации 60 мкг/мл, на аналогичные среды без препаратов получен рост типичных сухих, серо-желтых, шероховатых колоний МБТ - R-типа, что подтверждает бактериостатическое дей­ствие тубосана.

1         2         3         4         5

К         Hl       НЮ Т60          Т80

мкг/мл мкг мкг/мл мкг/мл

МКТ 4-Н-                               -1 -I- 4          4-           4-4-        4-4-

Рис. 40. Результаты посева культуры МБТ с ШЛУ на 21 день (клиниче­ский штамм 5657 - лекарственная устойчивость МБТ - SHRKEtEbCapPAS). Наблюдается устойчивость МБТ к изониазиду 1 и 10 мкг/мл и умеренное бактериостатическое действие тубосана 60 и 80 мкг/мл с изменением типа колоний на влажные слизистые.
1  пробирка - контроль - сплошной рост культуры МБТ на среде Левен­штейна - Йенсена (+++)
2   пробирка - сплошной рост МБТ на среде Левенштейна - Йенсена с изониазидом 1 мкг/мл (+++)
3   пробирка - единичный рост МБТ на среде Левенштейна - Йенсена с изониазидом 10 мкг/мл (+)
5 и 6 пробирки - уменьшение количества колоний МБТ на среде Левен­штейна - Йенсена с тубосаном 60 и 80 мкг/мл по сравнению с контролем (++). Изменение типа колоний - влажные, блестящие, гладкие, «слизистые». При микроскопии подтверждено уменьшение массивности роста МБТ на средах с тубосаном по сравнению с контролем и с изониазидом. При кон­трольном пересеве на среды без препаратов получен рост типичных сухих, серо-желтых, шероховатых колоний МБТ, что подтверждает восстановление свойств микобактерий на средах без тубосана.

        МБТ, расширили результаты исследований, проведенных Е.Н. Голо­щаповой (1997) и Н.М. Голощаповым (2000, 2002) в отношении изо­фона. В литературе сообщается, что метилдиоксотетрагидропирими­дин сульфонизоникотиноил гидразид (изофон) обладает противоту­беркулезным действием в отношении микобактерий туберкулеза ле­карственно чувствительных штаммов Academia и H37RV с мини­мальной ингибирующей концентрацией 64 мкг/мл.
 Авторами было сделано заключение, что метилдиоксотетрагид­! ропиримидин сульфонизоникотиноил гидразид (изофон) уступает по противотуберкулезной активности изониазиду, но имеет значительно меньшую токсичность. В наших исследованиях выявлены следующие дополнительные противотуберкулезные свойства тубосана:
Противотуберкулезную активность тубосан проявил in vitro на всех клинических штаммах МБТ в концентрациях 20, 60, 80 и 100 :       мкг/мл.
В отношении лекарственно чувствительных штаммов МБТ тубосан проявил бактерицидную   активность в диапазоне концентраций 20 - 100 мкг/мл
:При множественной и широкой лекарственной устойчивости МБТ тубосан в диапазоне концентраций 60 - 80 мкг/мл оказывает противотуберкулезное действие в 100% случаев, из них в 71% случа­ев проявляет бактериостатическую активность и в 29% случаев бак­терицидное действие. Тубосан в концентрациях 60 и 80 мкг/мл обладает бактери­цидным действием на штаммы МБТ, устойчивые к изониазиду  мкг/мл, при сохранении чувствительности к изониазиду 10 мкг/мл. Тубосан в концентрациях 60 и 80 мкг/мл обладает бактерио­статическим действием на штаммы МБТ, устойчивые к изониазиду 10 j мкг/мл, включая МЛУ и ШЛУ МБТ.  Следовательно, по нашим данным, бактериостатическое действие тубосана в диапазоне концентраций 20 - 100 мкг/мл проявляется не !    только в уменьшении массивности роста колоний МБТ, но также в
изменении типа колоний с R-типа на S-тип со сниженной жизнеспособностью МБТ. Наиболее выраженное бактерицидное и бактерио­статическое действие тубосан проявлял в концентрации 60 мкг/мл.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

   По результатам доклинического исследования мы выделили наиболее важные новые фармакологические характеристики тубосана, значимые для применения препарата в клинической практике:

  • Тубосан имеет низкую токсичность (ЛД 50 по острой токсич­ности превышает 15000 мкг/мл), в т.ч. по сравнению с изониазидом (ЛД 50 150 мкг/мл). Препарат не проявляет мутагенности, эмбриоток­сичности, тератогенности, канцерогенности, а также аллергизирующего действия.
  • Тубосан проявляет выраженную иммуностимулирующую ак- I тивность с улучшением показателей Т- В- и фагоцитарного звена им­мунитета. Воздействие на все три звена иммунитета с механизмом действия в виде улучшения синтеза РНК в клетках позволяет отнести тубосан к «универсальным» иммунопрепаратам, применение которо­го с высокой степенью вероятности будет эффективным при любой форме и фазе туберкулеза, вне зависимости от индивидуальной фор­мулы иммунных расстройств.
  • Анаболические свойства тубосана могут служить дополни­тельным показанием для использования препарата у больных с тяже­лыми формами туберкулеза, выраженной интоксикацией и дефици­том веса.
  •  Тубосан обладает противотуберкулезным действием, оказывая бактерицидный эффект на лекарственно чувствительные штаммы МБТ и изониазид-резистентные (изониазид 1 мкг/мл). В отношении изониазид-резистентных штаммов (изониазид 10 мкг/мл) тубосан в концентрации 60-80 мкг/мл проявляет умеренную бактериостатиче­скую активность.
  • Наиболее выраженное бактерицидное и бактериостатическое действие тубосан проявляет в концентрации 60 мкг/мл.
  • При приеме внутрь концентрация в крови достигает максимум через 3-6 часов и в меньшей концентрации сохраняется в течение 12­, 18 часов.
  • Наличие сульфоновой группы в препарате предполагает уси­ление действия других антибиотиков, совместно используемых с ту- босаном. Потенцирующий эффект других препаратов необходимо учитывать в клинической практике.

Таким образом, тубосан является малотоксичным препаратом, проявляющим бифункциональные свойства - противотуберкулезные и иммунотропные, что определило его применение у больных рас­пространенными деструктивными формами туберкулеза с клиниче­скими и лабораторными признаками иммунодефицита, при плохой переносимости или непереносимости изониазида, у больных с мно­жественной лекарственной устойчивостью МБТ.




+ - при росте МБТ от единичных колоний до 20 колоний
++ - при росте МБТ от 20 до 100 колоний
+++ - при росте более 100 колоний
+++ S - S тип колоний
ЛЧ МБТ - лекарственно чувствительные штаммы МБТ
ЛУ МБТ - лекарственная устойчивость МБТ
Контроль! - рост МБТ на среде без препаратов
Контроль2 - рост МБТ на среде без препаратов (посев МБТ 10-6)
Н - изониазид, Т - тубосан, S - стрептомицин, R - рифампицин, К- канами- цин, Et - этионамид, ЕЬ - этамбутол, Сар - капреомицин, PAS - ПАСК, Of - офлоксацин, Cs - циклосерин